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  聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后,我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析,也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析,分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下,我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。
      实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied biosystems公司推出,在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,使每一个循环变得“可见”,最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。


      现在市场上荧光定量PCR主要有两种方式:Taqman探针法(左)和SYBR Green I染料法(右)。原理分别如下:


     如果用于RNA检测,这被称为逆转录实时PCR即(Real-time RT-PCR)是实时PCR法,它是指对DNA或经过反转入(RT-PCR)的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程,在扩增的指数增长期就测量扩增产物,因为扩增指数增长期测量值与特异DNA(RNA)起始量存在相关性,从而实现定量检测。RealTime PCR的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸,从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差,实现DNA/RNA的精确定量。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量,而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点,该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。
     miRNAs起源于内源性表达转录本,是长约21-25nt的双链RNA分子,其典型特征是具有发卡结构。下图表述了对当前miRNA和siRNA起源的理解。miRNA途径开始于一个miRNA基因的pri-miRNA(PrimarymiRNA)转录本(step 1);这个70-100nt的发卡RNAs(pri-miRNA)在核内被核糖核酸酶Drosha加工处理而最终成为pre-miRNA(Precursor miRNA,)(step 2);之后pre-miRNA被核输出蛋白exportin 5转运入胞质(step 3),接着被第二个核糖核酸酶Dicer消化为21-25nt的miRNA(step 4);这个阶段的miRNA可以结合RISC(RNA-Induced Silencing Complex)并与靶标mRNA互补并列(step5-6);miRNA和靶序列的互补程度决定了靶基因mRNA要不在翻译水平被部分抑制,要不完全断裂(step 7)。植物体中,断裂似乎是主要的工作方式,而哺乳动物中则以翻译水平的抑制为主要方式。

          siRNA途径是由导入外源的双链RNA(dsRNA)所触发的一种进化上保守的反应(step A);这种双链的dsRNA被核糖核酸酶Dicer消化为大约21-23nt的siRNA(small interfering RNAs)(step B);siRNA又与RISC相互作用导致siRNA双链的解离并与靶标mRNA互补并列(step C-D);siRNA与它的靶标mRNA有近乎完美的互补,从而导致mRNA在这些互补位点直接断裂(step E);科学家们就是人为的设计这种dsRNA或者siRNA达到对靶基因的降解。这些合成的沉默试剂作为一种新的生物学工具,极大的促进了新基因鉴定、基因功能分析和信号通路的研究。

       miRNA在细胞分化,生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用,越来越多的引起研究人员的关注。随着对于miRNA作用机理的进一步的深入研究,以及利用最新的例如miRNA芯片等高通量的技术手段对于miRNA和疾病之间的关系进行研究,将会使人们对于高等真核生物基因表达调控的网络理解提高到一个新的水平。这也将使miRNA可能成为疾病诊断的新的生物学标记,还可能使得这一分子成为药靶,或是模拟这一分子进行新药研发,这将可能会给人类疾病的治疗提供一种新的手段。从近年来miRNA发表的文章数量来看,miRNA的相关研究呈现出越来越热的阶段。

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